Abstract: The generation of genetic diversity via mutagenesis is routinely used for protein engineering and pathway optimization. Current technologies for random mutagenesis often target either the whole genome or relatively narrow windows. To bridge this gap, we developed CoMuTER (Confined Mutagenesis using a Type I-E CRISPR-Cas system), a tool that allows inducible and targetable, in vivo mutagenesis of genomic loci of up to 55 kilobases. CoMuTER employs the targetable helicase Cas3, signature enzyme of the class 1 type I-E CRISPR-Cas system, fused to a cytidine deaminase to unwind and mutate large stretches of DNA at once, including complete metabolic pathways. The tool increases the number of mutations in the target region 350-fold compared to the rest of the genome, with an average of 0.3 mutations per kilobase. We demonstrate the suitability of CoMuTER for pathway optimization by doubling the production of lycopene in Saccharomyces cerevisiae after a single round of mutagenesis. Resumen: La generación de diversidad genética mediante mutagénesis es utilizada habitualmente para la ingeniería de proteínas y la optimización de vías metabólicas. Las tecnologías actuales para realizar mutagénesis aleatoria a menudo se dirigen a todo el genoma o a secuencias relativamente estrechas de ADN. Para cerrar esta brecha, desarrollamos CoMuTER (mutagénesis confinada utilizando un sistema CRISPR-Cas tipo I-E, por sus siglas en inglés), una herramienta que permite la mutagénesis in vivo inducible y dirigida de loci genómicos de hasta 55 kilobases. CoMuTER emplea la helicasa Cas3, enzima distintiva del sistema CRISPR-Cas clase 1 tipo I-E, fusionada a una citidina desaminasa para desenrollar y mutar grandes extensiones de ADN a la vez, incluidas vías metabólicas completas. La herramienta aumenta en un 350 veces el número de mutaciones en la región objetivo en comparación con el resto del genoma, con un promedio de 0,3 mutaciones por kilobase. Demostramos la idoneidad de CoMuTER para la optimización de vías al duplicar la producción de licopeno en Saccharomyces cerevisiae después de una sola ronda de mutagénesis.

Abstract: This thesis revolves around Metarhizium, fungi well-known for their entomopathogenic nature but recently discovered to have multifaceted lifestyles. They thrive in soil as saprophytes and engage in plant rhizospheres, positively impacting plant health. However, the mechanisms underlying these interactions remain elusive. The thesis examines Metarhizium brunneum's connections with plants, insects, and pathogens through five distinct chapters. These chapters entail: 1) identifying fungal isolates' differences and their efficacy as biocontrol agents, 2) exploring their association with crops, particularly oilseed rape and potatoes, and understanding their effects on insect pests and plant diseases, 3) studying the impact on herbivores like Psylliodes chrysocephala, Myzus persicae, and Brevicoryne brassicae feeding on Brassica napus plants, 4) evaluating their influence on the cabbage root fly (Delia radicum) and the mechanisms involved in plant defense pathways, and 5) examining their ability to protect oilseed rape plants against Verticillium longisporum, dissecting the mechanisms through in vitro and greenhouse experiments. These research aspects collectively elucidate the potential applications of Metarhizium brunneum and contribute to a deeper understanding of its role in agricultural systems. Resumen: Esta tesis gira en torno a Metarhizium, hongos bien conocidos por su naturaleza entomopatógena, pero de los que recientemente se ha descubierto que tienen estilos de vida polifacéticos. Prosperan en el suelo como saprofitos y se introducen en las rizosferas de las plantas, influyendo positivamente en su salud. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a estas interacciones siguen siendo elusivos. La tesis examina las conexiones de Metarhizium brunneum con plantas, insectos y patógenos a través de cinco capítulos distintos. Estos capítulos comprenden: 1) identificar las diferencias de los aislados fúngicos y su eficacia como agentes de biocontrol, 2) explorar su asociación con los cultivos, en particular la colza y la patata, y comprender sus efectos sobre las plagas de insectos y las enfermedades de las plantas, 3) estudiar el impacto sobre herbívoros como Psylliodes chrysocephala, Myzus persicae, y Brevicoryne brassicae que se alimentan de plantas de Brassica napus, 4) evaluar su influencia en la mosca de la raíz de la col (Delia radicum) y los mecanismos implicados en las vías de defensa de las plantas, y 5) examinar su capacidad para proteger las plantas de colza oleaginosa contra Verticillium longisporum, diseccionando los mecanismos mediante experimentos in vitro y en invernadero. Estos aspectos de la investigación dilucidan colectivamente las aplicaciones potenciales de Metarhizium brunneum y contribuyen a una comprensión más profunda de su papel en los sistemas agrícolas.

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